Analyse des macrophages méthode 1

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Méthode générale
Campagnes Analyse des macrophages Méthode 1 Campagne 1 : 2017
Analyse des macrophages Méthode 1 Campagne 2 : 2017
Analyse des macrophages Méthode 1 Campagne 3 : 2017

Analyse des macrophages

Traitement des données spectrales Raman

L’analyse des spectres Raman consistait tout d’abord en un lissage et en une correction polynomiale de la ligne de base. Cette étape de prétraitement a été effectuée via Labspec 6 (version 6.1.197, Jobin Yvon Technology, France). Les paramètres de prétraitement sélectionnés sont les suivants :
- un lissage de Savitzky-Golay, de type polynomial, pour un degré de 3 et une fenêtre de 12 points pour les spectres points. Alors que pour les images spectrales le lissage est de type « DeNoise » pour un facteur de 3 et une fenêtre de 5 points. - un polynôme de degré 3 pour la correction de la ligne de base avec une fenêtre de 12 points pour les spectres points et de 27 points pour les images spectrales.
La suite du traitement pour les spectres points est la suivante :
A partir des spectres points, des spectres moyens du cytoplasme et du noyau sont calculés par lame. Au total, 12 spectres moyens ont été calculés. A ces spectres, s’ajoute le calcul de 4 spectres moyens de milieux de culture seuls.
A partir des spectres moyens en milieux surchargés et non surchargés et en se basant sur la littérature, nous avons procédé à l’attribution des bandes caractéristiques Raman.
Ensuite, une simple soustraction des différents spectres moyens deux à deux a été réalisée entre les différentes conditions de culture.
Cette soustraction permet d’identifier, s’il y a lieu, des régions spectrales permettant la discrimination entre différents milieux.
Toutefois, la confirmation de la contribution des bandes identifiées nécessite des analyses statistiques supplémentaires. Il est important de noter que la soustraction a été réalisée après normalisation des spectres. La normalisation est effectuée par rapport au maximum de la bande 986-1014 cm-1 attribuée à la phénylalanine.
En dernier lieu, nous avons effectué une analyse en composantes principales (Partial Least Squares-Discriminant Analysis) en s’appuyant sur le package SAISIR sous Matlab 7.12.0 (The MathWorks Inc., USA).
La suite du traitement pour les images spectrales est la suivante :
Après le lissage et la correction de la ligne de base, nous avons procédé à l’élimination des spectres aberrants ou de faibles intensités. Ensuite et toujours via Labspec 6, la distribution relative des lipides dans la cellule a été suivie en projetant la contribution du rapport de bandes 2800-2870/ 1425-1476 cm-1. La bande à 2800-2870 cm-1 est attribuée à νsym (CH2) des lipides, celle à 1425-1476 cm-1 correspond à la déformation δ (CH) des protéines et des lipides.

Afin de mieux visualiser la contribution des espèces biochimiques, un CLS fitting (Classical Least Squares) a été réalisé en se basant sur des spectres types (spectres de références). Les spectres de références utilisés sont les spectres moyens des différents milieux de culture, que ce soit dans le noyau, ou le cytoplasme, ainsi que d’autres spectres types préalablement disponibles dans la base de données au laboratoire comme le spectre de référence de l’ADN, de l’ARN et des phospholipides.

En dernier lieu, la déconvolution des bandes à 1200-1400 cm-1 (attribution) et à 2750-3160 cm-1 (caractéristique des vibrations d’élongation CH des lipides) a permis de ressortir les bandes spectrales représentant la contribution des lipides sous le massif des vibrations correspondantes aux différents constituants des cellules. La contribution des bandes déconvoluées est ensuite observée sur l’ensemble de l’image.

A part la visualisation de la contribution de différentes bandes, avec ou sans déconvolution, et la projection de rapport de bandes ; un spectre moyen est extrait par image. Une dérivée de second ordre (degré 4, 17 points) est effectuée sur l’ensemble des spectres moyens, plus précisément sur deux régions spectrales (1200-1400 cm-1et 2750-3160 cm-1). Une comparaison des dérivées est effectuée dans l’espoir de ressortir des zones spectrales discriminantes selon les conditions de culture.



Module:Analyse_des_macrophages_méthode_1